melting - Online en la nube

PROGRAMA:

NOMBRE

fusión - cálculo del vecino más cercano de la hibridación de ácidos nucleicos

SINOPSIS

fusión [opciones]

DESCRIPCIÓN

Fusión calcula, para un dúplex de ácido nucleico, la entalpía y la entropía de la hélice-
transición de la bobina, y luego su temperatura de fusión. Tres tipos de hibridación son
posible: ADN / ADN, ADN / ARN y ARN / ARN. El programa utiliza el método de
vecinos. El conjunto de parámetros termodinámicos se puede cambiar fácilmente, por ejemplo
siguiendo un avance experimental. Melting es un programa gratuito en ambos sentidos de la
término. Viene sin costo y es de código abierto. Además está codificado en ISO C y
se puede compilar en cualquier sistema operativo. Se proporcionan algunos scripts de Perl para mostrar cómo
Melting se puede utilizar como bloque para construir programas más ambiciosos.

CAMPUS

Las opciones se tratan de forma secuencial. Si hay un conflicto entre el valor de dos
opciones, la última normalmente borra la primera.

-Aarchivo.nn
Informa al programa a utilizar archivo.nn como un conjunto alternativo de vecino más cercano
parámetros, en lugar de los predeterminados para el tipo de hibridación especificado. los
La distribución estándar de fusión proporciona algunos archivos listos para usar: all97a.nn
(Allawi et al 1997), bre86a.nn (Breslauer et al 1986), san96a.nn (SantaLucia et al.
1996) sug96a.nn (Sugimoto y otros 1996) san04a.nn (Santalucia et al 2004) (ADN / ADN),
fre86a.nn (Freier et al 1986), xia98a.nn (Xia et al 1998), (ARN / ARN) y sug95a.nn
(Sugimoto et al 1995), (ADN / ARN).

El programa buscará el archivo en un directorio especificado durante la
instalación. Sin embargo, si se define una variable de entorno NN_PATH, la fusión
busque en este primero. Cuidado, la opción -A cambia el parámetro predeterminado
conjunto definido por la opción -H.

-Csecuencia_complementaria
Entra en la secuencia complementaria, de 3 'a 5'. Esta opción es obligatoria si hay
son desajustes entre las dos hebras. Si no se utiliza, el programa calculará
como complemento de la secuencia ingresada con la opción -S.

-Ddnadnade.nn
Informa al programa para usar el archivo dnadnade.nn para calcular la contribución de
extremos colgantes a la termodinámica de la transición hélice-bobina. Los extremos colgantes son
no tomado en cuenta por el modo aproximado.

-Ffactor
Este es el factor de corrección utilizado para modular el efecto del ácido nucleico.
concentración en el cálculo de la temperatura de fusión. Ver sección ALGORITMO
para obtener más detalles.

-Gx.xxe-xx
Concentración de magnesio (No hay concentración máxima por el momento). El efecto
de iones sobre la estabilidad termodinámica de los dúplex de ácidos nucleicos es compleja,
y las funciones de corrección son, en el mejor de los casos, aproximaciones aproximadas.
Fórmula de corrección de tm para iones divalentes Mg2 + de Owczarzy et al(2008 lata
tener en cuenta la unión competitiva de iones monovalentes y divalentes en el ADN.
Sin embargo, esta fórmula es solo para dúplex de ADN.

-h Muestra una pequeña ayuda y sale con EXIT_SUCCESS.

-Htipo_hibridación
Especifica el tipo de hibridación. Esto configurará el conjunto de vecinos más cercanos para usar si
la opción no proporciona ningún conjunto alternativo -A (recuerde que las opciones se leen
secuencialmente). Además, este parámetro determina la ecuación a utilizar si el
la longitud de la secuencia excede el límite de aplicación del enfoque del vecino más cercano
(creado arbitrariamente por el autor). Los valores posibles son ADN, ADN y rnadna
(sinónimo), y marna. Por razones de compatibilidad los valores del anterior
versiones de derretir A, B, C, F, R, S, T, U, W todavía están disponibles aunque se mostró plenamente
obsoleto. Usa la opción -A para requerir un conjunto alternativo de termodinámicos
parámetros. IMPORTANTE: Si el dúplex es un heterodúplex de ADN / ARN, la secuencia del
La hebra de ADN debe ingresarse con la opción -S.

-Ifichero de entrada
Proporciona el nombre de un archivo de entrada que contiene los parámetros de la ejecución. La entrada
tiene que contener un parámetro por línea, formateado como en la línea de comando. El orden
no es importante, así como las líneas en blanco. ejemplo:

###comienzo###
-Hdnadna
-Asug96a.nn
-SAGCTCGACTC
-CTCGAGGGTGAG
-N0.2
-P0.0001
-v
-Ksan96a

###fin###

-iarchivo.nn
Informa al programa que utilice file.nn como un conjunto alternativo de pares de inosina
parámetros, en lugar de los predeterminados para el tipo de hibridación especificado.
La distribución estándar de fusión proporciona algunos archivos listos para usar:
san05a.nn
(Santalucia et al 2005) para desoxiinosina en dúplex de ADN, bre07a.nn (Brent M
Znosko
et al 2007) para inosina en dúplex de ARN. Tenga en cuenta que no toda la inosina
no coincide
Se han investigado los pares de wobble. Por lo tanto, podría ser imposible
calcular
la Tm de un dúplex con pares de inosina. Además, esos pares de inosina no son
toma
en cuenta por el modo aproximado.

-Kcorrección_sal
Permite elegir otra corrección para la concentración de sodio. En la actualidad,
uno puede elegir entre mojado91a, san96a, san98a. Ver sección ALGORITMO. TP. BI.
"-k" "x.xxe-xx"
Concentración de potasio (No hay concentración máxima por el momento). El efecto
de iones
sobre la estabilidad termodinámica de los dúplex de ácidos nucleicos es compleja, y la
de corrección
funciones son, en el mejor de los casos, aproximaciones aproximadas.
fórmula para
Los iones de sodio de Owczarzy et al (2008) también son aplicables a los tampones.
que contiene Tris o
KCl. Los iones monovalentes de K +, Na +, Tris + estabilizan los dúplex de ADN
con potencia similar, y sus efectos sobre la estabilidad dúplex son aditivos.
Sin embargo, esta fórmula
es solo para dúplex de ADN.

-L Imprime la información legal y sale con EXIT_SUCCESS.

-Mdnadnamm.nn
Informa al programa para usar el archivo dnadnamm.nn para calcular la contribución de
desajustes con la termodinámica de la transición hélice-espiral. Tenga en cuenta que no todos los
Se han investigado las parejas de Crick que no coinciden. Por lo tanto, podría ser imposible
para calcular la Tm de un dúplex no coincidente. Además, esos desajustes no se toman
en cuenta por el modo aproximado.

-Nx.xxe-xx
Concentración de sodio (entre 0 y 10 M). El efecto de los iones sobre la termodinámica.
La estabilidad de los dúplex de ácidos nucleicos es compleja y las funciones de corrección
son en el mejor de los casos aproximaciones aproximadas. Además, generalmente solo son confiables
para [Na +] perteneciente a [0.1,10 M]. Si no hay otros iones en
solución, podemos usar solo la corrección de sodio. En el otro caso, usamos el
De Owczarzy
algoritmo.

-Oarchivo de salida
La salida se dirige a este archivo en lugar de la salida estándar. El nombre de
El archivo se puede omitir. Entonces se genera un nombre automático, de la forma
meltingYYYYMMMDD_HHhMMm.out (por supuesto, en sistemas compatibles con POSIX, puede emular
esto con la redirección de stdout a un archivo construido con la fecha del programa).

-Px.xxe-xx
Concentración de la hebra de ácido nucleico en exceso (entre 0 y 0.1 M).

-p Devuelve el directorio que se supone que contiene los conjuntos de parámetros calorimétricos y
salir con EXIT_SUCCESS. Si se establece la variable de entorno NN_PATH, se devuelve.
De lo contrario, se devuelve el valor definido por defecto durante la compilación.

-q Desactive la corrección interactiva del parámetro introducido incorrectamente. Útil para correr
a través de un servidor o un script por lotes. El valor predeterminado es APAGADO (es decir, interactivo encendido). los
El interruptor funciona en ambos sentidos. Por tanto, si -q se ha configurado en un archivo de entrada, otro
-q en la línea de comando apagará el modo silencioso (lo mismo si dos -q se establecen
en la misma línea de comando).

-Ssecuencia
Secuencia de una hebra del dúplex de ácido nucleico, ingresada de 5 'a 3'. IMPORTANTE: Si
es un heterodúplex de ADN / ARN, debe introducirse la secuencia de la hebra de ADN.
La uridina y la timidina se consideran idénticas. Las bases pueden ser superiores o
minúsculas.

-Txxx Umbral de tamaño antes del cálculo aproximado. El enfoque del vecino más cercano
se utilizará solo si la longitud de la secuencia es inferior a este umbral.

-tx.xxe-xx
Concentración de tampón Tris (No hay concentración máxima por el momento).
El efecto de los iones sobre la estabilidad termodinámica del ácido nucleico.
dúplex es complejo, y las funciones de corrección son, en el mejor de los casos
aproximaciones aproximadas La fórmula de corrección de Tm publicada para iones de sodio de
Owczarzy y al(2008), por lo tanto, también es aplicable a tampones que contienen Tris o
KCl. Los iones monovalentes K +, Na +, Tris + estabilizan los dúplex de ADN con similares
potencia, y
sus efectos sobre la estabilidad dúplex son aditivos. Sin embargo, esta fórmula es solo para
ADN
duplex. Tenga cuidado, la concentración de iones Tris + es aproximadamente la mitad del total
búfer tris
concentración.

-v Controle el modo detallado, emitiendo mucha más información sobre la ejecución actual (intente
una vez para ver si puedes conseguir algo interesante). El valor predeterminado es APAGADO. El interruptor
funciona en ambos sentidos. Por tanto, si -v se ha configurado en un archivo de entrada, otro -v on
la línea de comando apagará el modo detallado (lo mismo si dos -v están establecidos en
la misma línea de comando).

-V Muestra el número de versión y sale con EXIT_SUCCESS.

-x Obligue al programa a calcular una tm aproximada, basada en el contenido de G + C. Esta opción
debe usarse con precaución. Tenga en cuenta que tal cálculo es cada vez más incorrecto cuando
la longitud del dúplex disminuye. Además, no tiene en cuenta nucleic
concentración de ácido, que es un grave error.

ALGORITMO

Termodinámica of bobina de hélice transición of nucleico ácido
El enfoque del vecino más cercano se basa en el hecho de que la transición de la hélice-bobina funciona como
una cremallera. Después de una unión inicial, la hibridación se propaga lateralmente.
Por lo tanto, el proceso depende de los nucleótidos adyacentes en cada hebra (la de Crick
pares). Dos dúplex con los mismos pares de bases pueden tener diferentes estabilidades, y en
por el contrario, dos dúplex con secuencias diferentes pero conjuntos idénticos de pares de Crick
tendrá las mismas propiedades termodinámicas (ver Sugimoto et al. 1994). Este programa
Primero calcula la entalpía y la entropía de hibridación a partir de los parámetros elementales de
cada par de Crick.

DeltaH = deltaH (iniciación) + SUM (deltaH (par de Crick))
DeltaS = deltaS (iniciación) + SUM (deltaS (par de Crick))

Ver Wetmur JG (1991) y SantaLucia (1998) para revisiones profundas sobre el ácido nucleico.
hibridación y en el conjunto diferente de parámetros del vecino más cercano.

Efecto of desajustes y colgado termina
También se tienen en cuenta los pares que no coinciden. Sin embargo, los parámetros termodinámicos
todavía no están disponibles para todos los casos posibles (especialmente cuando ambas posiciones están
no coinciden). En tal caso, el programa, incapaz de calcular ningún resultado relevante, se cerrará
con una advertencia.

Las dos primeras posiciones y no pueden coincidir. en tal caso, el resultado es
impredecible, y todos los casos son posibles. por ejemplo (ver Allawi y SanLucia 1997),
el duplex

AT
Gtgagctcat
TACTCGAGTG
ejército de reserva

es más estable que

AGTGAGCTCATT
Ttactcgagtga

Los extremos colgantes, es decir, los nucleótidos terminales no emparejados, pueden tenerse en cuenta.

Ejemplo
DeltaH (
Agcgatga-
-CGCTGCTTTT
) = DeltaH (AG / -C) + DeltaH (A- / TT)
+ DeltaH (initG / C) + DeltaH (initA / T)
+ DeltaH (GC / CG) + DeltaH (CG / GC) + 2xDeltaH (GA / CT) + DeltaH (AA / TT)
+ Delta (desajuste AT / TG) + DeltaG (desajuste TC / GG)

(El mismo cálculo se realiza para DeltaS)

El fusión temperatura
Luego, la temperatura de fusión se calcula mediante la siguiente fórmula:

Tm = DeltaH / (DeltaS + Rx ln ([ácido nucleico] / F))
Tm in K (para [Na +] = 1 M)
+ f ([Na +]) - 273.15
elimina necesidad de pilares angulados para la concentración de sal (si solo hay cationes de sodio en el
solución) y obtener la temperatura en grados Celsius. (De hecho, algunas correcciones son
directamente incluido en el DeltaS ver el de SanLucia 1998)

Corrección para las concentración of nucleico ácido
Si la concentración de las dos hebras es similar, F es 1 en caso de autocomplementación
oligonucleótidos, 4 en caso contrario. Si una hebra está en exceso (por ejemplo, en PCR
experimento), F es 2 (en realidad, la fórmula tendría que usar la diferencia de
concentraciones en lugar de la concentración total, pero si el exceso es suficiente, la
Se puede suponer que la concentración total es idéntica a la concentración de la hebra en
exceso).

Sin embargo, tenga en cuenta que MELTING asume que no hay autoensamblaje, es decir, el cálculo hace
no tomar ningún término entrópico para corregir la autocomplementariedad.

Corrección para las concentración of sal
Si solo hay iones de sodio en la solución, podemos usar las siguientes correcciones:

La corrección se puede elegir entre mojado91a, presentado en Wetmur 1991 es decir,
16.6 x log ([Na +] / (1 + 0.7 x [Na +])) + 3.85

san96a presentado en SantaLucia et al. 1996 es decir,
12.5 x log [Na +]

y san98a presentado en SantaLucia 1998 es decir, una corrección del término entrópico sin
modificación de la entalpía
DeltaS = DeltaS ([Na +] = 1M) + 0.368 x (N-1) x ln [Na +]

Donde N es la longitud del dúplex (SantaLucia 1998 en realidad usó 'N' el número de
fosfatos terminales, que es efectivamente igual a nuestro N-1). PRECAUCIÓN, esta corrección es
destinado a corregir los valores de entropía expresados ​​en cal.mol-1.K-1 !!!

Corrección para las concentración of iones cuando otros monovalente iones tal as Tris + y K+ or
bivalente Mg2 + iones en adicional
Si solo hay iones de Na +, podemos usar la corrección para la concentración de sal (ver
encima). En caso contrario, utilizaremos la corrección de iones de magnesio y monovalentes.
de Owczarzy et al (2008). (solo para dúplex de ADN)

[Lun +] = [Na +] + [K +] + [Tris +]

Donde [Tris +] = [tampón Tris] / 2. (en la opción -t, es la concentración de tampón Tris
que se ingresa).

Si [Mon +] = 0, los iones divalentes son los únicos iones presentes
y la temperatura de fusión es:

1 / Tm (Mg2 +) = 1 / Tm (1M Na +) + a - bx ln ([Mg2 +]) + Fgc x (c + dx ln ([Mg2 +]) + 1 / (2 x (Nbp -
1)) x (- e + fx ln ([Mg2 +]) + gx ln ([Mg2 +]) x ln ([Mg2 +]))

donde: a = 3.92 / 100000. b = 9.11 / 1000000. c = 6.26 / 100000. d = 1.42 / 100000. e =
4.82 / 10000. f = 5.25 / 10000. g = 8.31 / 100000. Fgc es la fracción de pares de bases GC en
la secuencia y Nbp es la longitud de la secuencia (Número de pares de bases).

Si [Mon +]> 0, hay varios casos porque podemos tener una unión de ADN competitiva
entre cationes monovalentes y divalentes:

Si la relación [Mg2 +] ^ (0.5) / [Mon +] es inferior a 0.22, la influencia de los iones monovalentes es
Los cationes dominantes, divalentes pueden descartarse y la temperatura de fusión es:

1 / Tm (Mg2 +) = 1 / Tm (1M Na +) + (4.29 x Fgc - 3.95) x 1/100000 x ln ([lun +]) + 9.40 x 1/1000000
x ln ([Lun +]) x ln ([Lun +])

donde: Fgc es la fracción de pares de bases GC en la secuencia.

Si se incluye la relación [Mg2 +] ^ (0.5) / [Mon +] en [0.22, 6 [, debemos tener en cuenta tanto
Concentraciones de cationes monovalentes y Mg2 +. La temperatura de fusión es:

1 / Tm (Mg2 +) = 1 / Tm (1M Na +) + a - bx ln ([Mg2 +]) + Fgc x (c + dx ln ([Mg2 +]) + 1 / (2 x (Nbp -
1)) x (- e + fx ln ([Mg2 +]) + gx ln ([Mg2 +]) x ln ([Mg2 +]))

donde: a = 3.92 / 100000 x (0.843 - 0.352 x [Lun +] 0.5 x ln ([Lun +])).
b = 9.11 / 1000000. c = 6.26 / 100000.
d = 1.42 / 100000 x (1.279 - 4.03 / 1000 x ln ([lun +]) - 8.03 / 1000 x ln ([lun +] x
En ([mon +]). e = 4.82 / 10000. f = 5.25 / 10000. g = 8.31 / 100000 x (0.486 -
0.258 x ln ([mon +]) + 5.25 / 1000 x ln ([mon +] x ln ([mon +] x ln ([mon +]).

Fgc es la fracción de pares de bases de GC en la secuencia y Nbp es la longitud de la secuencia
(Número de pares de bases).

Finalmente, si la relación [Mg2 +] ^ (0.5) / [Mon +] es superior a 6, la influencia de los iones divalentes es
Los cationes monovalentes dominantes pueden descartarse y la temperatura de fusión es:

1 / Tm (Mg2 +) = 1 / Tm (1M Na +) + a - bx ln ([Mg2 +]) + Fgc x (c + dx ln ([Mg2 +]) + 1 / (2 x (Nbp -
1)) x (- e + fx ln ([Mg2 +]) + gx ln ([Mg2 +]) x ln ([Mg2 +]))

donde: a = 3.92 / 100000. b = 9.11 / 1000000. c = 6.26 / 100000. d = 1.42 / 100000. e =
4.82 / 10000. f = 5.25 / 10000. g = 8.31 / 100000.

Fgc es la fracción de pares de bases de GC en la secuencia y Nbp es la longitud de la secuencia
(Número de pares de bases).

Largo secuencias
Es importante darse cuenta de que el enfoque del vecino más cercano se ha establecido en
pequeños oligonucleótidos. Por lo tanto, el uso de la fusión en el modo no aproximado es
realmente exacto solo para secuencias relativamente cortas (aunque si las secuencias son dos
En resumen, digamos <6 pb, la influencia de las extremidades se vuelve demasiado importante y la
la fiabilidad disminuye mucho). Para secuencias largas se ha diseñado un modo aproximado.
Este modo se inicia si la longitud de la secuencia es mayor que el valor dado por la opción
-T (el umbral predeterminado es 60 pb).

La temperatura de fusión se calcula mediante las siguientes fórmulas:

ADN / ADN:
Tm = 81.5+16.6*log10([Na+]/(1+0.7[Na+]))+0.41%GC-500/size

ADN / ARN:
Tm = 67+16.6*log10([Na+]/(1.0+0.7[Na+]))+0.8%GC-500/size

ARN / ARN:
Tm = 78+16.6*log10([Na+]/(1.0+0.7[Na+]))+0.7%GC-500/size

Sin embargo, este modo es se mostró plenamente desanimado.

Observaciones comentarios
Actualmente, la fusión es precisa solo cuando la hibridación se realiza a pH 71.

El cálculo es válido solo para las hibridaciones realizadas en medio acuoso.
Por lo tanto, el uso de agentes desnaturalizantes como la formamida invalida completamente la
resultados.

Referencias

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ADN. Bioquímica 36: 10581-10594

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Desajustes internos de GA en el ADN. Bioquímica 37: 2170-2179

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Para revisar ver:

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Sondas de ADN de Wetmur JG (1991): aplicaciones de los principios del ácido nucleico
hibridación. Crit Rev Bioquímica Mol Biol 26: 227-259

Use la fusión en línea usando los servicios de onworks.net