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eprimer32 - 选择 PCR 引物和杂交寡核苷酸

概要

引物32 -序列 后继 [-引物 切换] -任务 名单 [-杂交探针 切换]
-mishy库文件 入档 -错误启动库文件 入档 [-numreturn 整数]
[-包含区域 范围[-目标区域 范围[-排除区域 范围]
[-前向输入 绳子[-反向输入 绳子] -gccclamp 整数 -尺寸 整数
-最小 整数 -最大尺寸 整数 -otm 浮动 -薄荷 浮动 -最大 浮动
-最大差异 浮动 -ogc百分比 浮动 -mingc 浮动 -最大GC 浮动 -盐浓缩 浮动
-dnaconc 浮动 -maxpolyx 整数 -psizeopt 整数 -普兰奇 范围 -ptmopt 浮动
-ptmin 浮动 -ptmmax 浮动 -o 排除区域 范围 -寡核苷酸输入 绳子
-osizeopt 整数 - 最小化 整数 -maxsize 整数 -otmopt 浮动
-otmm 浮动 -otmmax 浮动 -ogcot 浮动 -ogcmin 浮动 -ogcmax 浮动
-盐酸盐 浮动 -odnacon 浮动 -oanyself 浮动 -自我 浮动
-opolyxmax 整数 -omishybmax 浮动 -解释标志 布尔 -文件标志 布尔
- 第一基索引 整数 -无论如何选择 布尔 -最大错误启动 浮动
-pairmax错误启动 浮动 -numns已接受 整数 -selfany 浮动 -自我结束 浮动
-校正 名单 -tm公式 名单 -最大稳定性 浮动 -输出文件 输出文件

引物32 -救命

商品描述

引物32 是来自 EMBOSS（“欧洲分子生物学公开赛”）的命令行程序
软件套件”）。 它是“Nucleic:Primers”命令组的一部分。

配置

输入 部分
-序列 后继
从中选择引物的序列。 序列必须从 5' 到 3'

-引物 切换
告诉 Eprimer32 选择引物默认值：Y

-任务 名单
告诉 Eprimer32 要执行什么任务。 合法值为 1：'选择 PCR 引物'，2：'选择
仅正向引物'，3：'仅选择反向引物'，4：'无需引物'。 默认
值：1

-杂交探针 切换
“内部寡核苷酸”旨在用作杂交探针（hyb 探针）以
扩增后检测 PCR 产物。 默认值：N

-mishy库文件 入档
类似于 MISPRIMING-LIBRARY，除了我们试图避免的事件是杂交
库中序列的内部寡核苷酸，而不是从它们启动。 这
文件必须是（稍微受限的）FASTA 格式（WB Pearson 和 DJ Lipman，
PNAS 85:8 pp 2444-2448 [1988])； 我们简要讨论这个文件的组织
以下。 如果指定了此参数，则 Eprimer32 本地对齐每个候选
oligo 针对每个文库序列并拒绝那些本地
对齐分数乘以指定的权重（见下文）超过
内部-OLIGO-MAX-MISHYB。 （权重的最大值任意设置为
12.0.) FASTA 格式文件中的每个序列条目必须以“id 行”开头
以“>”开头。 id 行的内容受到“轻微限制”，因为
Eprimer32 将任何可选星号 ('*') 之后的所有内容解析为浮点数
用作上述重量的数字。 如果 id 行不包含星号，则
权重默认为 1.0。 使用的对齐评分系统与
计算寡核苷酸之间的互补性（例如 SELF-ANY）。 条目的剩余部分
包含序列作为 id 行之后的行，直到以 '>' 开头的行
或文件的结尾。 空格和换行符被忽略。 字符“A”、“T”、“G”、
'C', 'a', 't', 'g', 'c' 被保留并且任何其他字符被转换为 'N'（带有
不明确碱基的任何 IUB / IUPAC 代码都转换为“N”的结果）。
行长没有限制。 此参数的空值表示
不应使用任何库。

-错误启动库文件 入档
包含要避免的序列的核苷酸序列库的文件的名称
扩增（例如重复序列，或可能是基因序列
不应被扩增的基因家族。）文件必须在（一个稍微受限的）
FASTA 格式（WB Pearson 和 DJ Lipman，PNAS 85:8 pp 2444-2448 [1988]）； 我们
下面简要讨论这个文件的组织。 如果指定了这个参数
然后 Eprimer32 将每个候选引物与每个文库序列进行局部比对，并
拒绝那些局部比对分数乘以指定权重的引物
（见下文）超过 MAX-MISPRIMING。 （权重的最大值任意
设置为 100.0。）FASTA 格式文件中的每个序列条目必须以“id”开头
行'以'>'开头。 id 行的内容在
Eprimer32 将任何可选星号 ('*') 之后的所有内容解析为浮点数
用作上述重量的数字。 如果 id 行不包含星号，则
权重默认为 1.0。 使用的对齐评分系统与
计算寡核苷酸之间的互补性（例如 SELF-ANY）。 条目的剩余部分
包含序列作为 id 行之后的行，直到以 '>' 开头的行
或文件的结尾。 空格和换行符被忽略。 字符“A”、“T”、“G”、
'C', 'a', 't', 'g', 'c' 被保留并且任何其他字符被转换为 'N'（带有
不明确碱基的任何 IUB / IUPAC 代码都转换为“N”的结果）。
行长没有限制。 此参数的空值表示
不应使用重复库。

额外 部分
教学计划 选项
-numreturn 整数
要返回的最大引物对数。 返回的引物对按以下顺序排序
它们的“质量”，换句话说，取决于目标函数的值（其中较低的
数字表示更好的引物对）。 注意：将此参数设置为大
值会增加运行时间。 默认值：5

序列 选项
-包含区域 范围
给定序列的子区域，在其中挑选引物。 例如，经常
序列的前十几个碱基是向量，应该从
考虑。 此参数的值的形式为 (start),(end) where (start)
是要考虑的第一个基数的索引，(end) 是最后一个
引物选择区。

-目标区域 范围
如果指定了一个或多个目标，则合法引物对必须至少位于一个
其中。 Target 可能是一个简单的序列重复位点（例如 CA 重复）或
单碱基对多态性。 该值应该是一个以空格分隔的列表
(start),(end) 对，其中 (start) 是 Target 的第一个碱基的索引，以及
(end) 是最后一个 例如 50,51 需要引物包围位置 2 处的 50 个碱基
和51。

-排除区域 范围
引物寡核苷酸不得与此标签中指定的任何区域重叠。 相关值
必须是以空格分隔的 (start),(end) 对列表，其中 (start) 是
排除区域的第一个碱基，和（结束）是最后一个。 这个标签很有用
用于排除低序列质量区域或排除区域等任务
包含重复元素，例如 ALU 或 LINE。 例如 401,407 68,70 禁止
选择从 7 开始的 401 个碱基和 3 处的 68 个碱基中的引物。

-前向输入 绳子
要检查的正向引物的序列以及围绕其设计反向引物的序列
和可选的内部寡核苷酸。 必须是 SEQUENCE 的子字符串。

-反向输入 绳子
要检查的反向引物的序列以及围绕其设计正向引物的序列
和可选的内部寡核苷酸。 必须是 SEQUENCE 反向链的子字符串。

底漆 选项
-gccclamp 整数
需要指定数量的连续 Gs 和 Cs 在两个的 3' 末端
正向和反向引物。 （这个参数对内部寡核苷酸没有影响，如果一个
被要求。）

-尺寸 整数
引物寡核苷酸的最佳长度（以碱基为单位）。 Eprimer32 将尝试挑选引物
接近这个长度。 默认值：20

-最小 整数
引物的最小可接受长度。 必须大于 0 且小于或等于
到最大尺寸。 默认值：18

-最大尺寸 整数
引物的最大可接受长度（以碱基为单位）。 目前这个参数不能
大于 35。此限制受 Eprimer32 的最大寡核苷酸大小控制
熔化温度有效。 默认值：27

-otm 浮动
引物寡核苷酸的最佳熔解温度（摄氏度）。 Eprimer32 会尽量挑
熔解温度接近这个温度的引物。 寡核苷酸熔化
Eprimer32 中的温度公式是在 Rychlik、Spencer 和 Rhoads、Nucleic 中给出的
酸研究，第 18 卷，第 21 期，第 6409-6412 页和 Breslauer、Frank、Bloecker 和 Marky，
过程国家队阿卡德。 科学。 美国，第 83 卷，第 3746-3750 页。 请参考之前的论文
背景讨论。 默认值：60.0

-薄荷 浮动
引物寡核苷酸的最低可接受熔解温度（摄氏度）。 默认值：
57.0

-最大 浮动
引物寡核苷酸的最大可接受熔解温度（摄氏度）。 默认值：
63.0

-最大差异 浮动
熔融温度之间的最大可接受（无符号）差异
正向和反向引物。 默认值：100.0

-ogc百分比 浮动
引物最佳 GC 百分比。 默认值：50.0

-mingc 浮动
任何引物中 Gs 和 Cs 的最小允许百分比。 默认值：20.0

-最大GC 浮动
Primer 生成的任何引物中 Gs 和 Cs 的最大允许百分比。 默认
值：80.0

-盐浓缩 浮动
PCR 中盐（通常是 KCl）的毫摩尔浓度。 Eprimer32 使用这个
计算寡核苷酸熔化温度的参数。 默认值：50.0

-dnaconc 浮动
PCR 中退火寡核苷酸的纳摩尔浓度。 Eprimer32 使用这个
计算寡核苷酸熔化温度的参数。 默认 (50nM) 与
Whitehead/MIT 基因组研究中心使用的标准协议--0.5
20 微升中每个引物寡核苷酸的微升浓度为 20 微摩尔浓度
与 10 纳克模板、0.025 单位/微升 Taq 聚合酶在 0.1 mM 中反应
每个 dNTP、1.5mM MgCl2、50mM KCl、10mM Tris-HCL (pH 9.3) 使用 35 个循环
退火温度56摄氏度。 这个参数对应于'c'
Rychlik、Spencer 和 Rhoads 的方程 (ii)（核酸研究，第 18 卷，第 21 期）
其中合适的值（对于较低的模板初始浓度）是“经验性的”
决定'。 该参数值小于实际浓度
反应中的寡核苷酸，因为它是退火寡核苷酸的浓度，在
转数取决于给定循环中模板（包括 PCR 产物）的数量。 这个
在 PCR 过程中浓度会大大增加； 幸运的是，PCR 似乎相当稳健
适用于各种寡核苷酸熔化温度。 请参阅选择引物的建议。 默认
值：50.0

-maxpolyx 整数
引物中单核苷酸重复的最大允许长度，例如
AAAAAA。 默认值：5

产品 选项
-psizeopt 整数
PCR 产物的最佳大小。 0 表示没有最优产品
尺寸。 默认值：200

-普兰奇 范围
相关值指定了用户想要的产品长度
要创建的引物，并且是形式为 (x)-(y) 的元素的空格分隔列表，其中
(x)-(y) 对是产品的合法长度范围。 例如，如果一个人想要
PCR 产物在 100 到 150 个碱基（含）之间，然后设置这个
参数为 100-150。 如果需要 100 到 150 范围内的 PCR 产物
碱基或在 200 到 250 个碱基的范围内，则可以将此参数设置为
100-150 200-250。 Eprimer32 倾向于参数字符串左侧的范围。
Eprimer32 将返回第一个范围内的合法引物对，而不管
这些对的目标函数。 只有在数量不足的情况下
第一个范围内的引物将 Eprimer32 返回后续范围内的引物。
默认值：100-300

-ptmopt 浮动
PCR 产物的最佳熔解温度。 0 表示没有
最佳温度。 默认值：0.0

-ptmin 浮动
扩增子的最低允许熔解温度。 请参阅文档
有关产品的最高熔化温度的详细信息。 默认值：
-1000000.0

-ptmmax 浮动
扩增子的最大允许熔解温度。 计算产品 Tm
使用 Bolton 和 McCarthy, PNAS 84:1390 (1962) 中的公式
Sambrook、Fritsch 和 Maniatis，分子克隆，第 11.46 页（1989 年，CS​​HL 出版社）。 Tm =
81.5 + 16.6(log10([Na+])) + .41*(%GC) - 600/长度 其中 [Na+} 是摩尔钠
浓度，(%GC) 是序列中 Gs 和 Cs 的百分比，长度是
序列的长度。 主要引物选择使用类似的公式
GCG 中的程序，它在最后一个学期使用 675.0/length（在 F. Baldino 之后，
Jr, M.-F. Chesselet, and ME Lewis, Methods in Enzymology 168:766 (1989) eqn (1) on
第 766 页，没有不匹配和甲酰胺术语）。 这里和巴尔迪诺的公式
等。 假设 Na+ 而不是 K+。 根据 JG Wetmur 的说法，在
生物化学。 和摩尔。 生物。 26:227 (1991) 50 mM K+ 在这些公式中应该是等价的
2 M Na+。 Eprimer32 使用相同的盐浓度值来计算
引物熔解温度和寡核苷酸熔解温度。 如果您打算
稍后使用 PCR 产物进行杂交，此行为不会为您提供 Tm
在杂交条件下。 默认值：1000000.0

全内走线 寡聚体 输入
-o 排除区域 范围
中间寡核苷酸不能与此标签指定的任何区域重叠。 相关值
必须是以空格分隔的 (start),(end) 对列表，其中 (start) 是
排除区域的第一个碱基，(end) 是最后一个。 通常一个人会让
目标区域排除了内部寡核苷酸的区域。

-寡核苷酸输入 绳子
要检查的内部寡核苷酸序列以及围绕其进行设计的序列
反向引物。 必须是 SEQUENCE 的子字符串。

全内走线 寡聚体 选项
-osizeopt 整数
内部寡核苷酸的最佳长度（以碱基为单位）。 Eprimer32 将尝试挑选引物
接近这个长度。 默认值：20

- 最小化 整数
内部寡核苷酸的最小可接受长度。 必须大于 0 且小于
或等于 INTERNAL-OLIGO-MAX-SIZE。 默认值：18

-maxsize 整数
内部寡核苷酸的最大可接受长度（以碱基为单位）。 目前这个参数
不能大于 35。此限制受最大寡核苷酸大小控制，其中
Eprimer32 的熔化温度是有效的。 默认值：27

-otmopt 浮动
内部寡核苷酸的最佳熔化温度（摄氏度）。 Eprimer32 将尝试
选择熔点接近此温度的寡核苷酸。 寡头
Eprimer32 中的熔融温度公式是 Rychlik、Spencer 和 Rhoads 中给出的，
核酸研究，第 18 卷，第 21 期，第 6409-6412 页和 Breslauer, Frank, Bloecker
和 Marky，Proc。 国家队阿卡德。 科学。 美国，第 83 卷，第 3746-3750 页。 请参考
用于背景讨论的原论文。 默认值：60.0

-otmm 浮动
内部寡核苷酸的最低可接受熔解温度（摄氏度）。 默认值：
57.0

-otmmax 浮动
内部寡核苷酸的最大可接受熔解温度（摄氏度）。 默认值：
63.0

-ogcot 浮动
内部寡核苷酸最佳 GC 百分比。 默认值：50.0

-ogcmin 浮动
内部寡核苷酸中 Gs 和 Cs 的最小允许百分比。 默认值：20.0

-ogcmax 浮动
引物生成的任何内部寡核苷酸中 Gs 和 Cs 的最大允许百分比。
默认值：80.0

-盐酸盐 浮动
杂交中盐（通常是 KCl）的毫摩尔浓度。 Eprimer32
使用此参数来计算内部寡核苷酸熔化温度。 默认值：
50.0

-odnacon 浮动
杂交中退火内部寡核苷酸的纳摩尔浓度。 默认
值：50.0

-oanyself 浮动
测试（本地）的内部寡核苷酸时允许的最大本地对齐分数
自我互补。 局部自互补被用来预测趋势
寡核苷酸自身退火 评分系统为互补碱基提供 1.00，
-0.25 表示任何碱基（或 N）与 N 匹配，-1.00 表示不匹配，-2.00 表示不匹配
差距。 只允许单碱基对间隙。 例如，比对 5' ATCGNA 3'
|| | | 3' TA-CGT 5' 是允许的（并产生 1.75 的分数），但比对 5'
ATCCGNA 3' || | | 3' TA--CGT 5' 不考虑。 分数是非负的，并且
0.00 的分数表示两个之间没有合理的局部对齐
寡核苷酸。 默认值：12.00

-自我 浮动
测试单个寡核苷酸时允许的最大 3' 锚定全局比对分数
为了自我互补。 评分系统与最大互补性相同
争论。 在上面的例子中，分数分别是 7.00 和 6.00。 分数是
非负值，0.00 表示没有合理的 3'-anchored
两个寡核苷酸之间的全局对齐。 为了估计 3'-锚定的全局
候选寡核苷酸的比对，引物假设要从中选择的序列
寡核苷酸呈 5' 到 3'。 INTERNAL-OLIGO-SELF-END 在应用于
用于基于杂交的检测的内部寡核苷酸，因为引物二聚体不会
发生。 我们建议将 INTERNAL-OLIGO-SELF-END 设置至少为
内部-寡核苷酸-自我-任何。 默认值：12.00

-opolyxmax 整数
内部寡核苷酸重复序列的最大允许长度，例如
AAAAAA。 默认值：5

-omishybmax 浮动
与 MAX-MISPRIMING 类似，只是该参数适用于
INTERNAL-OLIGO-MISHYB-LIBRARY 中指定的库的候选内部寡核苷酸。
默认值：12.0

先进的 部分
-解释标志 布尔
如果此标志为真，则生成 LEFT-EXPLAIN、RIGHT-EXPLAIN 和 INTERNAL-OLIGO-EXPLAIN
输出标签，旨在提供有关寡核苷酸数量的信息和
Eprimer32 检查的引物对，以及丢弃的数量统计
很多原因。 默认值：N

-文件标志 布尔
如果关联值为真，则 Eprimer32 为每个文件创建两个输出文件
输入序列。 File (sequence-id).for 列出了所有可接受的正向引物
(sequence-id) 和 (sequence-id).rev 列出了所有可接受的反向引物
(sequence-id)，其中 (sequence-id) 是 SEQUENCE-ID 标签的值（必须是
提供）。 另外，如果输入标签TASK是1或4，Eprimer32会产生一个文件
(sequence-id).int，其中列出了所有可接受的内部寡核苷酸。 默认值：N

- 第一基索引 整数
该参数是输入序列中第一个碱基的索引。 对于输入和
使用基于 1 的索引的输出（例如在 GenBank 中使用的索引以及许多用户使用的索引）
习惯）将此参数设置为 1。对于使用基于 0 的索引的输入和输出
将此参数设置为 0。（此参数也会影响内容中的索引
设置引物文件标志时生成的文件。）默认值：1

-无论如何选择 布尔
如果为 true，则选择引物对，即使是 LEFT-INPUT、RIGHT-INPUT 或 INTERNAL-OLIGO-INPUT
违反特定约束。 默认值：N

-最大错误启动 浮动
与 MISPRIMING-LIBRARY 中任何序列的最大允许加权相似性。
默认值：12.00

-pairmax错误启动 浮动
引物对加权相似性的最大允许总和（一个相似性
每个引物）与 MISPRIMING-LIBRARY 中的任何单个序列。 默认值：24.00

-numns已接受 整数
任何引物中允许的最大未知碱基数 (N)。

-selfany 浮动
测试单个引物时的最大允许局部比对分数（局部）
测试时的自我互补性和最大允许局部对齐分数
正向和反向引物之间的互补性。 局部自互补是
用来预测引物相互退火的趋势，而不必
在 PCR 中引起自引发。 评分系统给出1.00作为补充
碱基，-0.25 表示任何碱基（或 N）与 N 的匹配，-1.00 表示不匹配，以及 -2.00
为一个间隙。 只允许单碱基对间隙。 例如，对齐 5'
ATCGNA 3' ...|| | | 3' TA-CGT 5' 是允许的（并产生 1.75 的分数），但是
对齐 5' ATCCGNA 3' ...|| | | 3' TA--CGT 5' 不考虑。 分数是
非负，0.00 表示没有合理的局部
两个寡核苷酸之间的对齐。 默认值：8.00

-自我结束 浮动
测试单个引物时允许的最大 3'-锚定全局比对分数
自我互补，以及最大允许的 3' 锚定全局比对分数
在测试正向和反向引物之间的互补性时。 3'-锚定
使用全局比对分数来预测 PCR 引发的可能性
引物二聚体，例如 5' ATGCCCTAGCTTCCGGATG 3' ...............||| |||||
..........3' AAGTCCTATATTTAGCCTAGT 5' 或 5' AGCTATGGGCCTCGCGA 3'
........|||||| ............3' AGCGCTCCCGGGTATCGGA 5' 评分系统如下
对于最大互补性论证。 在上面的例子中，分数是 7.00
和 6.00 分别。 分数为非负数，分数为 0.00 表示
两个寡核苷酸之间没有合理的 3' 锚定全局对齐。 为了
估计候选引物和引物对的 3'-锚定全局比对，引物
假设从中选择引物的序列显示为 5' 到 3'。 这是
为该参数提供比最大值（本地）更大的值是荒谬的
互补参数，因为局部比对的分数将始终为
至少与全局对齐的分数一样大。 默认值：3.00

-校正 名单
指定熔解温度计算的盐校正公式。 默认
值：1

-tm公式 名单
指定熔化温度计算的详细信息。 默认值：1

底漆 罚款 权重
-最大稳定性 浮动
正向或反向引物的五个 3' 碱基的最大稳定性。 大
数字意味着更稳定的 3' 端。 该值是双工的最大增量 G
使用最近邻参数计算的五个 3' 碱基的中断
发表于 Breslauer、Frank、Bloecker 和 Marky，Proc。 国家队阿卡德。 科学。 美国，第 83 卷，
第 3746-3750 页。 Eprimer32 对向后使用完全允许的默认值
兼容性（我们可能会在下一个版本中更改）。 Rychlik 建议的最大值
9 (Wojciech Rychlik, 'Selection of Primers for Polymerase Chain Reaction' in
BA White 编辑，“分子生物学方法”，卷。 15：PCR 方案：当前方法
和应用程序”，1993 年，第 31-40 页，Humana Press，Totowa NJ）。 默认值：9.0

输出 部分
-输出文件 输出文件

使用 onworks.net 服务在线使用 eprimer32e